分享PIERCE超敏型發(fā)光液的使用及注意事項(xiàng)
瀏覽次數(shù)：2339發(fā)布日期：2022-03-26
PIERCE超敏型發(fā)光液直接或間接檢測(cè)與辣根過(guò)氧化物酶HRP關(guān)聯(lián)的蛋白或核酸底物。這一*的發(fā)光底物系統(tǒng)是目前靈敏的商業(yè)化熒光ECL檢測(cè)試劑，具有*靈敏度和高信噪比，可檢測(cè)出10-100fg的微量抗原；發(fā)光迅速，熒光可使X感光膠片感光達(dá)12小時(shí)以上，特別適用于痕量蛋白或核酸檢測(cè)。同時(shí)該試劑允許使用更高的抗體稀釋倍數(shù)，極其節(jié)省抗體。
PIERCE超敏型發(fā)光液的使用
1.常規(guī)電泳、跨膜、HRP標(biāo)記抗體或核酸探針培養(yǎng)和膜清洗。應(yīng)注意用HRP或夾心法標(biāo)記免疫球蛋白。將核酸雜交膜與HRP標(biāo)記探針雜交并清洗。
2.在清洗膜上用HRP標(biāo)記第二抗體的同時(shí)，新鮮制備工作液：將相同體積的A和B分別混合，置于室溫下，恢復(fù)熒光強(qiáng)度，否則熒光強(qiáng)度會(huì)減弱。建議立即使用工作液。它在室溫下幾小時(shí)后仍可以使用，但靈敏度略有降低。
3.用鑷子把膜取出，放在濾紙上，把乳液排出，但不要使膜*干燥。將薄膜*浸入并與發(fā)光工作液(約0.125 ml發(fā)光工作液/cm2薄膜)*接觸。在室溫下孵育3分鐘后，立即將薄膜壓平并曝光。長(zhǎng)孵育時(shí)間不會(huì)增加敏感性，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致異常暴露帶。發(fā)光過(guò)程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)。發(fā)光工作液太少不利于反應(yīng)，也會(huì)導(dǎo)致薄膜上條帶曝光不均勻，靈敏度大大降低。為了省錢(qián)，可以減少薄膜的用量，但不應(yīng)減少發(fā)光液的用量。
4.用鑷子拿起薄膜，放在濾紙上，放出發(fā)光工作液。但不要把光亮沖走。
5.將面積大于膠片的保鮮膜放在X射線(xiàn)膠片盒內(nèi)部。混合膜貼在保鮮膜上。混合膠卷被折疊起來(lái)并*包裹起來(lái)。去除氣泡和皺紋，并可切斷邊緣多余的保鮮膜。用濾紙吸收多余的熒光工作液。將覆蓋混合膜的保鮮膜用膠帶固定在暗盒中，推薦的蛋白帶朝上。
6.把X光膠片放在黑暗中，曝光時(shí)間不同，比如幾秒到幾分鐘。沖洗顯影液。
PIERCE超敏型發(fā)光液注意事項(xiàng)：
1.步驟1-5可以在熒光燈下操作，但在強(qiáng)光照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，發(fā)光液體的靈敏度可能會(huì)略有降低，因此可以避免移動(dòng)到暗室。戴手套可以避免在膜上留下指紋，保持膜的清潔。
2..長(zhǎng)期暴露或蛋白質(zhì)過(guò)量會(huì)加深背景，使帶強(qiáng)度變化失去線(xiàn)性關(guān)系。曝光不足會(huì)使波段變模糊。
3.膜上的帶在孵育3分鐘后會(huì)發(fā)光。暗室中肉眼可見(jiàn)強(qiáng)條帶，而低豐度蛋白條帶則較弱。雖然肉眼看不見(jiàn)，但它們可以曝光X光片。光波段的發(fā)光時(shí)間不能單獨(dú)用肉眼觀察來(lái)判斷。不可見(jiàn)熒光實(shí)際上持續(xù)數(shù)小時(shí)，使X射線(xiàn)膠片感光，因此弱帶可以暴露1-10小時(shí)。如果暴露后條帶不好，可使用洗滌緩沖液清洗膜，再次出現(xiàn)第二抗體，然后重新使用ECL燈和暴露。
4、由于PIERCE超敏型發(fā)光液的高靈敏度，強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1：1000-1：4000，二抗1：2000-1：5000。抗體濃度過(guò)高將造成高背景或沒(méi)有條帶，導(dǎo)致失敗！
5.一些商業(yè)保鮮膜封裝的壓印膜將熄滅熒光。選用優(yōu)質(zhì)保鮮膜，如“克林來(lái)”牌保鮮膜。
6.使用可見(jiàn)的預(yù)染色蛋白標(biāo)記和熒光放射自顯影曝光標(biāo)簽可以幫助確定膠片上條帶的確切位置和尺寸。
7.NaN3能抑制HRP的活性。第二種抗體回收后應(yīng)避免使用NaN3。如有必要，不得超過(guò)0.01%。
